1-9-1-3: منطقه II22
1-9-1-2: منطقه III22
1-9-1-4: قطعه IS1016 23
1-9-1-5: تعداد کپی جایگاه CAP24
1-9-1-6: تکامل ژنوم سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا25
1-9-1-7: ژنوتیپ های HIB27
1-10: روش های تعیین تعداد کپی جایگاه CAP در ژنوم هموفیلوس آنفلونزا:28
1-11: REAL-TIME PCR28
1-11-1: تعریف و مفهوم :28
1-11-2: مزایای روش REAL-TIME PCR:29
1-11-3: انواع روش های REAL-TIME PCR:29
1-11-4: روش های تعیین کمیت با REAL-TIME PCR:32
1-11-4-1: ABSOLUTE QUANTIFICATION :32
1-11-4-2: چگونگی رسم یک منحنی استاندارد:32
1-11-4-3: RELATIVE QUANTIFICATION33
1-11-5: کاربرد های REAL-TIME PCR:34
1-12: بیان مساله34
1-13: ضرورت انجام تحقیق35
1-14: اهداف پژوهش36
فصل دوم: مروری بر متون گذشته
2-1: مطالعات انجام شده در ایران38
2-2: مطالعات انجام شده در خارج از ایران39
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1: محیط های کشت43
3-1-1: محیط کشت شکلات آگار43
3-1-1-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز43
3-1-1-2: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار43
3-1-2: محیط کشت آگار خون دار44
3-1-2-1: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار44
3-1-3: محیط کشت BHI+ SUPPLEMENT مایع44
3-1-3-1: مواد و دستگاه های مورد نیاز44
3-1-3-2: روش تهیه 500 میلی لیتر محیط کشت BHI+ SUPPLEMENمایع44
3-2: کشت نمونه ها45
3-3: فریز کردن باکتری45
3-3-1: مواد و تجهیزات لازم45
3-3-2: روش فریز کردن45
3-4: شناسایی عمومی هموفیلوس آنفلونزا46
3-4-1: تست نیاز های غذایی46
3-4-2: رنگ آمیزی گرم46
3-4-2-1: مواد و تجهیزات لازم46
3-4-2-2: روش رنگ آمیزی گرم46
3-5: واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)47
3-5-1: استخراج DNA از باکتری به روش جوشاندن47
3-5-1-1: مواد و تجهیزات لازم47
3-5-1-2: روش استخراج48
3-5-2: پرایمرها48
3-5-2-1: آماده سازی پرایمرها49
3-5-3: برنامه PCR49
3-5-4: تهیه مستر میکس PCR50
3-5-4-1: مواد و تجهیزات لازم50
3-5-4-2: روش تهیه مسترمیکس50
3-5-5: تهیه 500 میلی لیتر بافر TAE 10X53
3-5-5-1: مواد و تجهیزات لازم53
3-5-5-2: روش تهیه بافر53
3-5-6: الکتروفورز محصول PCR53
3-5-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز53
3-5-6-2: تهیه ژل آگارز جهت الکتروفوز53
3-5-6-3: روش الکتروفورز محصول PCR54
3-6: استخراج PRP54
3-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز54
3-6-2: تهیه ML50 محلول CTAB 0.5 M54
3-6-3: تهیه ML 50 محلول NACL 0.4 M55
3-6-4: روش استخراج PRP55
3-7: اندازه گیری PRP به روش بیال56
3-7-1: مواد و تجهیزات لازم56
3-7-2: روش اندازه گیری PRP56
3-8:تعیین تعداد کپی CAP با استفاده از REAL-TIME PCR:57
3-8-1: مواد و تجهیزات لازم:57
3-8-2: شرایط واکنش:57
3-8-3: کمیت سنجی مطلق(ABSOLUTE QUANTIFICATION):59
3-8-3-1: انجام و تخلیص محصول PCR برای منحنی استاندارد59
3-8-3-2: تهیه منحنی استاندارد60
3-8-4: کمیت سنجی نسبی (RELATIVE QUANTIFICATION):62
3-9: تعیین ژنوتیپ نمونه ها با استفاده از PCR :62
فصل چهارم: نتایج
4-1: نتایج روش های تشخیص عمومی65
4-1-1: نتایج نیاز غذایی65
4-1-2: نتایج رنگ آمیزی گرم65
4-2: نتایج آزمون PCR66
4-2-1: تایید هموفیلوس آنفلونزای کپسول دار بودن نمونه ها66
4-2-2: تایید تیپ B بودن نمونه ها68
4-2-3: نتیجه نهایی PCR69
4-2-4: مشاهده سوش جهش یافته HIB‾ در میان نمونه ها72
4-3: نتایج سنجش PRP به روش بیال72
4-4: نتایج REAL-TIME PCR73
4-4-1: کمیت سنجی نسبی:74
4-4-2: کمیت سنجی مطلق:77
4-5: نتایج تعیین ژنوتیپ:82
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-1: بحث و نتیجه گیری84
5-3: پیشنهادات87
منابع ……………………………………………………………………………………………………………. 89
خلاصه انگلیسی98
فهرست جداول
جدول 1-1: نیاز گونه های مختلف هموفیلوس به فاکتورهای مختلف به فاکتورهای X و V7
جدول 1-2: بیوتایپ های هموفیلوس آنفلونزا8
جدول 3-1: لیست پرایمرها برای تایید HIB48
جدول 3-2: برنامه PCR50
جدول 3-3: مواد PCR52
جدول3-4: پرایمرهای اولیگونوکلئوتیدی استفاده شده برای REAL TIME PCR58
جدول3-5: مواد واکنش برای REAL-TIME PCR61
جدول3-6 : برنامه واکنش REAL-TIME PCR61
جدول 3-7: پرایمر های مورد استفاده برای تعیین ژنوتیپ نمونه های منتخب63
جدول 3-8: برنامه دمایی واکنش PCR برای پرایمرهای K و L63
جدول 4-1: لیست نمونه ها و نتایج PCR70

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب(به صورت کاملا تصادفی و به صورت نمونه) با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود-این مطالب صرفا برای دمو می باشد

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

جدول 4-2: میزان PRP نمونه های هموفیلوس آنفلونزا تیپ B73
جدول 4-3 : نمونه های منتخب و میزان PRP74
جدول4-4: کمیت سنجی نسبی ژن RPOB و قطعه IS106 توسط REAL-TIME PCR75
جدول4-5: کمیت سنجی نسبی ژن RPOB و ژن CAPB توسط REAL-TIME PCR75
جدول4-6: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه RPOB78
جدول 4-7: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه CAPB78
جدول 4-8: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه IS101678
جدول4-9: نتایج کمیت سنجی مطلق (تعداد کپی) جایگاه های RPOB, IS1016 و CAPB 79
جدول 4-10 : تعداد کپی جایگاه های CAPB و IS1016 نسبت به جایگاه تک کپی RPOB 80
فهرست تصاویر
شکل1-1: انتشار باسیل های گرم منفی، هموفیلوس و سایر باکتریهای نرمال و سخت رشد5
شکل 1-2: تست نوارهای X ، V و XV7
شکل 1-3: ساختار پلی ساکارید های کپسولی هموفیلوس آنفلونزا (تیپ های A-F)10
شکل 1-4: تظاهرات کلینیکی بیماریهای با عامل HIB بصورت درصد14
شکل 1-5: کشورهایی که از سال 1997 تا 2012 به برنامه واکسیناسیون علیه HIB پیوستن18
شکل 1-6: نقشه ژنتیکی حلقوی HAEMOPHILUS INFLUENZA RD20
شکل 1-7: ساختار ژنتیکی جایگاه CAP در هموفیلوس آنفلونزا سروتایپ های A,B,C,D,E,F21
شکل 1-8: جایگاه CAP و ژن های تشکیل دهنده24
شکل 1-9 : درخت تکاملی سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا26
شکل1-10 : تفاوت های بین ژنوتیپ I و II در جایگاه CAP28
شکل 1-11: نحوه اتصال نشانگر سایبرگرین30
شکل1-12: مکانیسم عمل SYBR GREEN به عنوان عامل متصل شونده به DNA31
شکل1-13: رسم منحنی استاندارد.33
شکل 3-1: ویال های آماده برای PCR روی یخ52
شکل 4-1: رشد باکتری در حضور دیسک XV و عدم رشد در حضور دیسک X و V65
شکل 4-2: رنگ آمیزی گرم نمونه ها نشان دهنده کوکوباسیل های گرم منفی66
شکل 4-3: نتایج PCR برای ست پرایمر A و B 67
شکل 4-4: نتایج PCR برای ست پرایمر C و D69
شکل 4-5: مدل های پیشنهادی برای جایگاه CAPB در نمونه های انتخاب شده81
شکل4-6: نتایج PCR تعیین ژنوتیپ نمونه ها82
فهرست نمودارها
نمودار 4-1: بیان نسبی CAPB نسبت به ژن مرجع RPOB76
نمودار 4-2: بیان نسبی IS1016 نسبت به ژن مرجع RPOB76
نمودار 4-3: تعداد کپی در دو جایگاه CAPB و IS1016 نسبت به جایگاه RPOB در نمونه ها80
خلاصه فارسی
هموفیلوس آنفلونزای تیپ‌ب (Hib) از مهمترین عوامل ایجاد مننژیت باکتریال در نوزادان و کودکان می‌باشد. مهمترین عامل بیماری‌زایی این باکتری کپسول پلی‌ساکاریدی از جنس PRP می‌باشد که تولید آن تحت کنترل گروهی از ژنها می‌باشد که در جایگاهی به نام capb قرار دارند. واکسیناسیون علیه این بیماری در بیشتر کشورهای جهان انجام شده ولی ایران هنوز به طرح واکسیناسیون سراسری نپیوسته است، به همین دلیل تولید واکسن بومی هموفیلوس آنفولانزا یک ضرورت محسوب می‌شود. هدف از این مطالعه آنالیز مولکولی ژنوم باکتری برای انتخاب یک سویه بومی واکسینال می‌باشد. در این تحقیق ابتدا نمونه‌های مشکوک به روش PCR و با استفاده از 4 جفت پرایمر اختصاصی شناسایی شد، میزان PRP نمونه‌ها به روش بیال اندازه‌گیری شد، سپس تعداد کپی جایگاه cap در نمونه‌های منتخب به روش Real Time PCR و با استفاده از 3 جفت پرایمر طراحی شده برای مناطق IS1016، capb و ژن تک‌کپی rpoB با متد Abslute Quantification مشخص شد. در نهایت ژنوتیپ نمونه‌های منتخب با استفاده از دو جفت پرایمر اختصاصی مشخص شد.از میان 30 نمونه 18 مورد Hib ،11 مورد غیر از هموفیلوس آنفلونزا و یک مورد Hib‾ تشخیص داده شد. از میان 5 نمونه منتخب دو نمونه دارای 3 کپی از جایگاه cap بوده و 3 نمونه دارای دو کپی از این جایگاه تشخیص داده شدند. در مرحله آخر تمام 5 نمونه ژنوتیپ I تشخیص داده شدند. در این مطالعه برای اولین بار در ایران تعیین تعداد کپی و ساختار ژنوم جایگاه cap در سویه‌های بومی انجام شد.
کلمات کلیدی: هموفیلوس آنفلونزا، Real time PCR، مننژیت ، Hib
فصل اول
کلیات
1-1: تاریخچه
هموفیلوس آنفلونزا برای اولین بار در سال 1892 به وسیله فایفر جدا گردید و تا اوایل دهه 1930، اکثر دانشمندان آن را عامل مولد آنفلونزای اپیدمیک می دانستند. زیرا عموماً همراه با این بیماری بدست می آمد(8). در سال 1933 مسلم گرید که عامل بیماری آنفلونزا ویروس است و این باکتری یک مهاجم ثانوی در اپیدمیها می باشد(1). البته در پاندمی های اخیری که ویروس آنفلونزا عامل آن بوده، نقش نزدیک از این باکتری با ویروس آنفلونزا دیده نشده است و بدین دلیل مسئله سینرژیسمی بین ویروس و باکتری در بیماری های انسانی ناشناخته به نظر می رسد. بنابر این نام آنفلونزا اهمیت اتیولوژیک ندارد(8). آنفلونزا معمولا منصوب به عنوان ” flu”، یک بیماری ویروسی است که بوسیله التهاب حاد مسیر هوایی ناحیه فوقانی دستگاه تنفسی مشخص می گردد. علائم، اغلب با التهاب شدید غشاء مخاط بینی، سردرد، برونشیت و درد عضلانی عمومی شدید1 پیشرفت می کند(48).
کاملترین مطالعات توسط مارگارت پیتمن بین سالهای 1930 تا 1940 صورت گرفت ، او فیزیولوژی، بیماریزایی، مصونیت، اپیدمیولوژی و خصوصیات این باکتری را به صورت کامل شرح داد(1). نام جنس هموفیلوس از دو ریشه یونانی هم 2به معنای خون و فیلوس 3به معنای دوست داشتن گرفته شده است(20) . بر اساس کتاب باکتریولوژی برِگِی4، 10 گونه از هموفیلوسها در ارتباط با انسانها نام گذاری شده اند که یکی از آنها گونه آنفلونزا می باشد. بعلاوه 6 گونه نیز در ارتباط با حیوانات بوده و 3 گونه نیز حالت نامشخص دارند.
1-2: خصوصیات عمومی جنس هموفیلوس:
جنس هموفیلوس شامل باکتری های کوکوباسیلی یا میله ای شکل، گرم منفی، و پلئومورفیک بوده که در اسمیر های مستقیم ممکن است شکل آنها در زیر میکروسکوپ، از کوکوباسیل های کوچک تا فیلامنت های بلند متفاوت باشد(20). ابعاد آنها به ندرت از 3/0 × 5/1 میکرون تجاوز میکند. دو انتهای سلول آنها گرد بوده و کپسول در صورت مشاهده با میکروسکوپ در اشکال صاف وجود دارد(8). در نمونه های حاصل از عفونت های حاد، ارگانیسم ها به صورت باسیل های کوکوئیدی شکل کوتاه هستند که گاهی اوقات بصورت دوتایی یا زنجیره کوتاه قرار میگیرند(2). دو جنس هموفیلوس و پاستورلا، به خانواده پاستورلاسه تعلق دارند. از نظر خصوصیاتی، اعضای خانواده پاستورلاسه، گرم منفی، پلئومورفیک، کوکوئیدی، غیر متحرک، هوازی یا بی هوازی اختیاری بوده، نیتریت ها را در اثر احیاء نیتریت ها بدست می آورند و اکسیداز و کاتالاز + می باشند. شکل (1-1) شیوع این ارگانیسمهای سخت رشد را در ارتباط با دیگر باسیل های گرم منفی یافت شده در نمونه های کلینیکی نشان می دهد(48).
همانطور که گفته شد، هموفیلوس باکتری هوازی اختیاری است، اما به طور ضعیف در غیاب اکسیژن رشد می کند. افزایش 10-5 % Co2 بهمراه انکوباسیون، رشد بسیاری از سویه ها را افزایش می دهد. مقدار گوانین+ سیتوزین DNAی جنس هموفیلوسmole %44-37 می باشد(48) .
شکل1-1: انتشار باسیل های گرم منفی، هموفیلوس و سایر باکتریهای نرمال و سخت رشد

از حدود 17 گونه از هموفیلوس های شناخته شده عده ای جزء فلور طبیعی دهان و نواحی فوقانی دستگاه تنفس انسانها و عده ای نیز در حیوانات یافت می شوند(8). حدود 10% کل فلور باکتریایی دائمی دستگاه تنفسی فوقانی را هموفیلوس ها تشکیل می دهند(38). برخی از آنها در انسان بیماری زا می باشند(8). گونه اصلی بیماریزا هموفیلوس آنفلونزاست که بطور طبیعی در سیستم حلقی- دهانی برخی افراد سالم یافت می شود. بعضی از سویه های آنها دارای کپسول وبرخی دیگر فاقد آن هستند، که دسته بدون کپسول دارای قدرت بیماریزایی ضعیفتری نسبت به سویه های کپسولدار می باشند. هموفیلوس آنفلونزا در انسان ایجاد عفونت می کند(45) و مخزن حیوانی ندارد(10).
از گونه های عمده ساکن در دستگاه تنفسی فوقانی، گونه پاراآنفلونزاست که 4/3 % از کل میکروفلورهای هموفیلوس را در بر میگیرد. سویه های هموفیلوس آنفلونزای بدون کپسول معمولا چندین بیوتایپ داشته و در فارنکس بیشتر کودکان سالم یافت می شوند. اما به طور نرمال کمتر از 2% فلورهای باکتریایی کل را تشکیل می دهد. با افزایش سن افراد هموفیلوس آنغلونزا فراوانی کمتری را به عنوان فلور حلق نشان می دهد(38).

1-3: نیازهای غذایی
هوفیلوس آنفلونزا یکی از پر نیازترین باکتری ها بوده و به وجود خون در محیط کشت نیاز دارد(8). عدم توانایی رشد هموفیلوس در غیاب خون یا فرآورده های آن، مربوط به دو نیاز غذایی است که اولی، هِمین یا هِم شناسایی شد که به آن فاکتور X می گویند(73). این فاکتور به حرارت مقاوم بوده و برای رشد هوازی ارگانیسم مورد نیاز است(9). فاکتور X همچنین میتواند پروتوپورفیرین IX و دیگر ترکیبات منسوب به آن که دارای آهن هستند را شامل شود(17). این نوع ترکیبات برای سنتز آنزیم های تنفس هوازی ضروری بوده، از این رو، سویه ها برای رشد بی هوازی، به فاکتور X نیازی ندارند. عقیده بر این است که هِم برای سنتز کاتالاز لازم بوده و میتوان به جای آن سیستئین به کار برد. سیستئین، پراکسید را احیاء کرده و نیاز به کاتالاز را برطرف می سازد(8). احتیاج به این گروه از ترکیبات، به دلیل ناتوانی سویه های وابسته به X است که توانای تبدیل ALA 5 به پروتوپورفیرین را دارا نمی باشند، که پروسه ای دارای چندین مرحله با آنزیم های مختلف می باشد(17).
دومین فاکتوری که برخی از گونه های هموفیلوس برای رشد به آن وابسته است. نیکوتین آمید دی نوکلئوتید (NAD) و یا نیکوتین آمید دی نوکلئوتید فسفات شناسایی شده که به آن فاکتور V می گویند. (17،73). لازم به ذکر است که اسید نیکوتینیک یا نیکوتین آمید نمیتواند جایگزین این فاکتور شود. ظاهراً مولکول کوآنزیم کامل را باید فراهم کرد و بنظر می رسد که این ماده حساس به حرارت، همین فاکتور V نام برده می باشد که در عصاره مخمر، انواع سبزیجات و همچنین خون کامل یافت می شود(8).
هر دو فاکتور X و V در داخل گلبولهای قرمز خون یافت شده و برای رشد در محیط لازم می باشند(20). البته باید خاطر نشان کرد که گونه های مختلف ممکن است به یکی از فاکتورها و یا هر دوی آنها نیازمند باشند که الگوی وابستگی به X و V یا XV معیاری است برای تمایز بین گونه ها(جدول 1-1).
جدول 1-1: نیاز گونه های مختلف هموفیلوس به فاکتورهای مختلف به فاکتورهای X و V
Haemophilus speciesGrowth Factor RequirementsXVHaemophilus influenza++Haemophilus haemolyticus++Haemophilus ducreyi+-Haemophilus parainfluenzae-+Haemophilus parahaemolyticus-+Haemophilus segnis-+Haemophilus paraphrophilus-+Haemophilus aphrophilus–
لیز شدن گلبولهای قرمز توسط حرارت در زمان تهیه شکلات آگار باعث آزادسازی فاکتورهای رشدی X و V خواهد شد. همچنین آنزیم های هیدرولیز کننده فاکتور V نیز غیر فعال می شوند(20).
احتیاجات به دو فاکتور X یا V یا XV معمولا با به کار گیری تست دیسک در جایی که رشد و یا عدم رشد در اطراف دیسک های کاغذی را نشان می دهد مشاهده می شود(شکل 1-2).
شکل 1-2: تست نوارهای X ، V و XV
1-4: دسته بندی و تیپ بندی هموفیلوس آنفلونزا
1-4-1: بیوتایپ های هموفیلوس آنفلونزا:
باکتری هموفیلوس آنفلونزا بر اساس 3 تست بیوشیمیایی Indole, Urease, Ornithine decarboxylase به هشت بیوتایپ (زیست گروه) مختلف تقسیم می شود (جدول 1-2). سویه های مهاجم ایجاد کننده مننژیت اغلب جزء بیوتایپ I هستند در حالی که سویه های بدون کپسول (NTHi) ایجاد کننده بیماری، عموما جزء بیوتایپ II و III هستند.
ارتباط نزدیکی بین محل جداسازی هموفیلوس آنفلونزا و بیوتایپ های آن وجود دارد، به طوری که بیوتایپ I بیشتر عامل سپسیس و مننژیت است. عفونت های مجاری تنفسی، گوش میانی و چشم عموما توسط بیوتایپ های II و III ایجاد می شود و بیوتایپ IV بیشتر در ارتباط با عفونت های تناسلی است(53).
جدول 1-2: بیوتایپ های هموفیلوس آنفلونزا
Urnithine decarboxylaseUreaseIndoleBiotype+++I-++II-+-III++-IV+-+V+–VI–+VII—VIII
1-4-2: سروتایپ های هموفیلوس آنفلونزا:
در سال 1930 دو گروه اصلی برای هموفیلوس آنفلونزا در نظر گرفته شد:
– سویه های کپسول دار(encapsulate)
– سویه های بدون کپسول (unencapsulate)
سویه های کپسول دار بر اساس آنتی ژن کپسولی متمایز خود دسته بندی شدند. تا کنون شش سروتایپ کپسول دار از هموفیلوس آنفلونزا به رسمیت شناخته شده و به نام های a,b,c,d,e,f نام گذاری شده اند(62).
تنوع ژنتیکی در میان سویه های بدون کپسول بسیار بیشتر است .سویه های بدون کپسول ، nontypeable (NTHi) نامیده می شوند. زیرا قابل تیپ بندی بر اساس کپسول نیستند.
1-4-3: دیگر سیستم های دسته بندی:
سویه های کپسول دار همان طور که شرح داده شد بر اساس تفاوت در ساختار پلی ساکارید کپسولی به 6 زیرگروه تقسیم می شوند. سیستم های دیگر دسته بندی به سویه های بدون کپسول هموفیلوس آنفلونزا می پردازد که شامل: بیوتایپینگ، تفاوت بر اساس وزن مولکولی پروتئین غشاء بیرونی (نا همگنی آنتی ژنی)، دسته بندی بر اساس ناهمگنی آنتی ژنی لیپواولیگوساکاریدی(LOS) ، دسته بندی بر اساس تفاوت های ژنتیکی با استفاده از الکتروفورز، دسته بندی بر اساس روش RFLP و دسته بندی با استفاده از PCR می باشد(61).
1-5: خصوصیات پاتوژنیک
1-5-1: آنتی ژن کپسولی
سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا دار بر اساس پلی ساکارید گروه های سرولوژیکی هموفیلوس آنفلونزا به 6 سروتیپ a,b,c,d,e,f تقسیم می شوند(18). در شکل (1-3) ساختار کپسول سروتایپها نشان داده شده اند.
شکل 1-3: ساختار پلی ساکارید های کپسولی هموفیلوس آنفلونزا (تیپ های a-f)
آنتی ژن کپسولی پلی ساکارید در واقع پلیمری است که از دی ریبوزفسفات که به آن پلی ریبو فسفات (PRP) می گویند (18). مطالعات بعدی ریبیتول را به عنوان یک ترکیب سازنده اضافی بر این ساختار تشخیص داد و همچنین ساختاری را برای این پلی ساکارید پیشنهاد کرد که بر پایه ترکیبی اکی مولار از ریبوز، ریبیتول و فسفات می باشد(22).
به نظر می رسد که پلی ساکارید کپسولی (CP) این ارگانیسم، اساسی ترین شاخص بیماری زایی در عفونت های سیستمیکی می باشد که توسط هموفیلوس آنفلونزا تیپ b به وجود می آیند(12).
کپسول دارای خاصیت ناپایداری و بی ثباتی است به این معنا که کشت های متوالی6 ممکن است باعث از دست رفتن کپسول، پیدایش رشد ضعیف و اشکال پلئومورفیک یا چند شکلی شوند. موتانتهای فاقد کپسول7 که دارای کلنی های با ظاهر خشن می باشند، مواد کپسولی را تولید کرده اما آن را به سطح خارجی باکتری انتفال نمی دهند(18). در 5/0 – 1% از سوش های سیروتایپ b به صورت خود به خودی بیان کپسول خود را از دست می دهد. ولی در سیروتایپ های غیر از b از دست دادن کپسول تا کنون گزارش نشده است (34)
تیپ هموفیلوس آنفلونزای کپسول دار را می توان به کمک آنتی سرم های اختصاصی از طریق آزمایشات تورم کپسولی تعیین نمود. این آزمون، مشابه کوالانگ در پنوموکوکها می باشد. به وسیله روش ایمنوفلورسانس نیز می توان بطور مشابهی تیپ باکتری را تعیین نمود. اغلب هموفیلوس آنفلونزاهای فلور طبیعی مجاری تنفسی فوقانی، فاقد کپسول هستند(2). کپسول در غیاب آنتی بادی ضد کپسولی فاکتور عمده ویرولانس محسوب می شود(8).
1-5-2: فاکتورهای ویرولانس و آنتی ژن های دیگر:
در ساختمان آنتی ژن سوماتیک هموفیلوس آنفلونزا حداقل دو پروتئین وجود دارد. ماده P که قسمت اعظم وزن باکتری را تشکیل می دهد و ماده M که آنتی ژن سطحی ناپایدار می باشد.
از کشت مایع این باکتری، معمولا اندوتوکسین لیپوپلی ساکاریدی خاصی به دست می آید که ماهیت آنتی ژنی آن مشابه نایسریا می باشد(9). از دیگر فاکتورهای ویرولانس این ارگانیسم بعد از کپسول، می توان IgA پروتئاز، پروتئین های غشاء خارجی (OMP) ، لیپوالیگوساکارید (LOS) و پروتئین های ادهسین8 یا چسبندگی را نام برد(18).
1-5-3: عوامل تشکیل کلنی و ویرولانس
اولین مرحله در بیماری زایی کلونیزه شدن باکتری در قسمت های فوقانی دستگاه تنفس است. در این پروسه، برای اینگه هموفیلوس آنفلونزا بتواند ایجاد عفونت های سیستمیک کند،باید چسبندگی به سطوح مخاطی دستگاه تنفسی را به دست آورد، سپس از میان سلولهای اپیتلیال و اندوتلیال گذشته، پس از نفوذ به خون در بافتهای دیگر مستقر شده و در اندام هدف صدمه به سلولها را ایجاد کند.
پیلی: چسبندگی به وسیله پیلی در بسیاری از سویه ها تسهیل می شود. اگرچه این ساختارها ممکن است تنها عامل چسبندگی نباشند، زیرا در برخی سویه های فاقد پیلی قدرت چسبندگی به سلولهای اپیتلیال مسیر هوایی وجود دارد(60). به دنبال تشکیل کلنی ممکن است تغییر در فنوتیپ پیلی دار به نوع فاقد پیلی رخ دهد که رویداد مهمی محسوب می شود، زیرا در ظهور بعدی بیماری واریانت های بدون پیلی توانایی بهتری در حمله به اپیتلیوم دارا هستند(27،44).
کپسول: مهمترین نقش را در پاتوژنز بیماری تهاجمی بازی میکند و دارای خواص ضد فاگوسیتی در غیاب آنتی بادی های ضد کپسولی و همچنین دارای فعالیت ضد کمپلمانی می باشد (50،36). مطالعات نشان میدهد که بیشتر سویه های فاقد کپسول دارای خاصیت چسبندگی به سلولهای اپیتلیال انسان می باشند. در حالی که اکثر سویه های سروتیپ b فاقد این خاصیت هستند. عدم توانایی چسبندگی در سروتایپ b ممکن است عاملی باشد برای ایجاد عفونت های سیستمیک به وسیله این سروتایپ، و وجود توانایی چسبندگی در سویه های بدون کپسول نیز ممکن است توضیح دهنده عفونت های لوکالیزه و محدود باشد(48).
پروتئین های غشاء خارجی و لیپوالیگوساکارید (LOS): اگرچه نقش این آنتی ژنها بطور کامل شناخته شده نیست، ولی می توان گفت که آنتی بادی هایی که مستقیما بر ضد این آنتی ژنها تولید می شوند نقش مهمی در ایمنی انسان بازی می کنند. هر کدام از این آنتی ژنها احتمالا مسئول توانایی های مختلفی مانند تهاجم، اتصال و عملکرد فاگوسیتی هستند. لیپوالیگوساکارید نیز دارای اثر فلج کننده و مختل کننده حرکت مژه های سلولهای اپیتلیوم دستگاه تنفسی می باشند.
IgA پروتئازها (IgA Proteases): همانطور که می دانیم ایمنوگلوبولین ترشحی کلاس A در سطوح موکوسی انسان یافت می شود. از میان همه گونه های هموفیلوس، تنها گونه آنفلونزا تولید IgA پروتئاز می کند. این آنزیم دارای توانایی شکستن IgA ترشحی بوده و تولید آن به این ارگانیسم پتانسیل ویرولانس بیشتری می بخشد (37،20).
1-6: علائم کلینیکی عفونتهای هوفیلوس آنفلونزا تیپ b
باید به این مساله تاکید داشت که همه سویه های هموفیلوس آنفلونزا دارای کپسول نمی باشند. بنابر این دو نوع مسیر برای بیماری های نسبت داده شده به این ارگانیسم وجود دارد:
الف- بیماری های تهاجمی ایجاد شده توسط سویه های کپسولدار (قابل تیپ بندی) بخصوص سروتایپ b که در آنها، باکتری و انتشار از طریق خون در بدن نقش مهمی دارد.
ب- بیشتر عفونتهای لوکالیزه را شامل می شود که توسط سویه های غیر کپسولدار (nontypeable) ایجاد شده و در داخل یا نزدیکی راه های تنفسی پدید می آیند.
مثال برای نوع اول بیماری های تهاجمی شامل: مننژیت، اپی گلوتیت، آرتریت، سلولیت و فارنژیت حاد، و مثال برای عفونت های لوکالیزه شامل: پنومونی و سینوزیت که خصوصا در بین بزرگسالان شایع می باشد(شکل 1-4).
گاهی نیز استثناهایی در دسته بندی کپسولدارها و غیر کپسولدارها در ایجاد بیماری بین کودکان و بزرگسالان اتفاق می افتد(32).
شکل 1-4: تظاهرات کلینیکی بیماریهای با عامل Hib بصورت درصد
به عنوان مثال برخی سویه های غیر کپسولدار گاهی قادر به ایجاد مننژیت در بزرگسالان هستند به خصوص در افراد ناتوان یا با ضعف سیستم ایمنی. علاوه بر آن می توانند در نوزادان ایجاد کننده سپسیس و در کودکان عامل عفونت های تهاجمی دستگاه تنفسی تحتانی باشند. دیگر سروتایپ های هموفیلوس آنفلونزا نیز به ندرت در انسان بیماریزا هستند (10،74).
1-6-1: مننژیت
مننژیت مهمترین و خطرناکترین بیماری است که توسط هموفیلوس آنفلونزا ایجاد می شود. سروتایپ b از هموفیلوس آنفلونزا معمول ترین عامل مننژیت در بین کودکان بین 3 ماه تا 6 سال می باشد (75). مننژیت ناشی از این باکتری شایع ترین شکل مننژیت سپتیک بوده که تقریبا در همه موارد به وسیله تیپ b ایجاد می شود(8). بطور مشخص، مننژیت هموفیلوسی پس از بیماری ضعیف چند روزه رخ می دهد و علائم بیماری ممکن است قطع شده و دوباره پدیدار شود. مرگ و میر در ارتباط با هموفیلوسی حدود 5-3% می باشد(25). علائم مننژیت ایجاد شده توسط این باکتری با سایر مننژیتهای باکتریایی در کودکان کمتر از 3 سال تفاوتی ندارد و مفصل در موارد کمتری گرفتار می شوند(9).
در طی بیماری مننژیت با عامل هموفیلوس آنفلونزا تیپ b، به دنبال کلونیزه شدن، تهاجم به جریان خونی و در نتیجه انتشار باکتریمی اتفاق می افتد. همچنین ارگانیسم در غشاء مخاط تنفسی شروع به تکثیر می کند.
از علائم این بیماری می توان سردرد، سفت شدن گردن9، تب وبی حالی، شوک و دیگر علائم رایج مننژیتی را نام برد(20). عواقب دراز مدت مننژیتی ناشی از این باکتری پراهمیت می باشد. بازماندگان، قریب یک سوم عوارض عصبی و روانی از جمله کری، اختلال در بیان و ناهنجاری های رفتاری پیدا می کنند و درصد کمی از بیماران نیز شدیداً آسیب دیده و به مراقبت های ویژه نیاز پیدا می کنند(8).
1-7:درمان:
1-7-1: واکسن های موثر و مقایسه آنها
قبل از معرفی واکسن های موثر، تقریبا از هر 200 کودک بین 5-1 سال، 1 کودک مبتلا به بیماری های تهاجمی Hib می شد. اما امروزه در کشوری مثل آمریکا، این میزان به 1 کودک در هر 100000 کودک تقلیل یافته است. که معمولا این میزان ابتلا نیز با عاملی غیر از سروتایپ b از این ارگانیسم رخ می دهد. اما متاسفانه هنوز در کشورهایی که توانایی اقتصادی برای واکسیناسیون عمومی موجود نیست، بیماری های با عامل Hib همچنان قربانی های زیادی دارد (78).
اولین نسل از واکسن های علیه بیماری های Hib، شامل پلی ساکاریدی خالص از جنس PRP با وزن مولکولی بالا بود که در سال 1985 در آمریکا معرفی شد (80). اما این واکسن که اولین واکسن تحت لیسانس به حساب می آید مانند دیگر واکسن های پلی ساکاریدی، پاسخ ایمنی به آن نیز وابسته به سن بود. بدین معنی که با وجود تاثیر قابل قبول در کودکان تازه به راه افتاده ، در نوزادان زیر 18 ماه قادر به ایجاد حفاظت نبود. این واکسن در سال 1988 از دور فروش خارج شد (76).
پس از ظهور کوتاه واکسن های پلی ساکاریدی ، نسل دوم واکسن های Hib به بازار آمد. این نسل از واکسن‌ها کونژوگه ای بود از پلی ساکارید PRP با یک حامل پروتئینی در حالت کوالانت بود.
اتصال پلی ساکارید به حامل پروتئینی ، به طور چشمگیری باعث افزایش توانایی سیستم ایمنی کودکان در شناسایی PRP و پاسخ به آن می شود (79). امروزه سه نوع مختلف از واکسن های کونژوگه وجود دارد که در هر کدام یک نوع پروتئین در پروسه کونژوگه کردن استفاده شده است و شامل: توکسوئید تتانوس (PRP-T)، پروتئین موتانت دیفتری(PRP-D) و پروتئین غشاء خارجی مننگوکوکی گروه b (PRP-ompc) است.
PRP-D (کپسول همراه با توکسوئید دیفتری) در نوزادان، حتی بعد از تزریق 3 دوز، از کمترین ایمنی زایی برخوردار بود. اما وقتی به عنوان یک بوستر در نوزادان 12-18 ماهه که در دوره اولیه سه تزریق آنها توسط PRP با کونژوگه دیگری بود، مورد استفاده قرار گرفت، ایمنی زایی خوبی را از خود نشان داد (58).
PRP-ompc یا کپسول کونژوگه با پروتئین غشاء خارجی بدست آمده از مننگوکوک، تنها کونژوگه ای است که آنتی بادی بالایی را پس از اولین تزریق در نوزادان دوماه سبب می شود. دوزهای بعدی، افزایش نسبتا کمی را تولید کرده و آخرین تیتر حتی کمتر از بقیه.(24)
واکسن PRP-T و واکسن کونژوگه کپسول به همراه توکسین به دست آمده از موتانت دیفتری، هر دو آنتی بادی کمی را پس از تزریق به نوزادان 4-2 ماه تولید می کنند. در حالی که میزان آنتی بادی بالایی را پس از تزریق در 6 ماهگی تولید می کنند. بنابر این از نظر تئوری، یک تزریق اولیه PRP-ompc در 2 ماهگی و تزریق دوم با PRP-T و یا با PRP متصل به توکسین موتانت دیفتری در سن 6-4 ماهگی و سومین تزریق با PRP-D در 15-12 ماهگی، می تواند پاسخ مطلوبی را به همراه داشته باشد (50).
جدا از هر نوع واکسنی که برای دوزهای اولیه انتخاب می شوند، زمانی که کودک در کمتر از 12 ماهگی است، تیترها به سرعت پایین می آیند، مگر در زمان یک تزریق مجدد (بوستر) که معمولا در 15-12 ماهگی صورت می پذیرد (56).
به منظور کاهش تعداد دفعات ضروری تزریق واکسن به کودکان نسل سوم این واکسن ها به تایید سازمان بهداشت جهانی (WHO10) رسیده که واکسنی پنتاوالانی (پنج ظرفیتی) است که ترکیبی از واکسن های مختلف از جمله دیفتری، تتانوس، سیاه سرفه و هپاتیت می باشد، اما هنوز مدارک و شواهد کافی در مورد تفاوت اثر این واکسن ها در مقایسه با واکسن های اختصاصی وجود ندارد (76، 77).
در مطالعه ای که بر روی نوزادان گامبیایی صورت گرفته است، اثر واکسن های کونژوگه Hib در این کشور در حال توسعه نشان دهنده کاهش بیماری و جلوگیری از اکثر موارد مننژیتی و پنومونی می باشد. بنابراین پیشنهاد شده است که این واکسن ها در کشور های در حال توسعه، مرگ و میر ناشی از این بیماری ها را در کودکان به طور قابل توجهی کاهش می دهد (52).

شکل 1-5: کشورهایی که از سال 1997 تا 2012 به برنامه واکسیناسیون علیه Hib پیوستند(36)
1-8: تشخیص:
تشخیص این باکتری در آزمایشگاه به طور معمول با استفاده از دو روش کشت و تست آگلوتیناسیون لاتکس11 (LAT) انجام می شود. روش مولکولی PCR نیز قابل انجام است که به صورت روتین در آزمایشگاه های تشخیصی انجام نمی شود.
1-8-1: روش کشت
کشت باکتریایی Hi بر روی آگار شکلاته به همراه فاکتور X 12 و V 13 در دمای 37 درجه سانتی گراد و غنی از Co2 انجام می شود. رنگ آمیزی گرم و مشاهده میکروسکوپی، باکتری را به صورت باسیل های گرم منفی نشان می دهد.
باکتری از نظر تولید آنزیم های اکسیداز و کاتالاز، مثبت است.
در ناحیه همولیتیک استاف اورئوس14 در محیط بلاد آگار رشد می کند زیرا در این ناحیه به دلیل همولیز خون، فاکتورV وجود دارد.
در محیط لوینتال15 سویه های کپسول دار کلنی های با نمای رنگین کمانی تولید می کنند. محیط فیلدز آگار16 بهترین محیط برای جدا سازی این باکتری می باشد.
1-8-2: روش آگلوتیناسیون لاتکس (LAT)
روش حساس تری نسبت به کشت می باشد زیرا این روش بر پایه آنتی ژن های باکتری های زنده انجام می شود که با آنتی بادی اختصاصی خود واکنش می دهد .
نتایج در این روش تحت تاثیر مصرف آنتی بیوتیک ها قرار نمی گیرد. همچنین این روش سریع تر از روش کشت بوده و قادر به تمایز سروتایپ های مختلف کپسول دار می باشد. با این حال نتایج آن نسبت به روش مولکولی از دقت کمتری برخوردار است (35).
1-8-3: روش مولکولی
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) بسیار حساس تر، اختصاصی تر و سریع تر از روش کشت و LAT می باشد (35،51). طراحی پرایمر برای شناسایی مولکولی سروتایپ های هموفیلوس آنفلونزا برای اولین بار در سال 1990 توسط وَن کِتِل17 و همکاران انجام شد (71). با این حال روش PCR هنوز به صورت روتین در آزمایشگاه ها مورد استفاده قرار نمی گیرد.
1-9: ژنوم هموفیلوس آنفلونزا:
هموفیلوس آنفلونزا اولین موجود زنده دارای توانایی تکثیر مستقل است که ژنوم آن به طور کامل تعیین توالی شد. پروژه ژنوم هموفیلوس آنفلونزا در سال 1995 توسط ونتر18 همکاران انجام شد.
هموفیلوس آنفلونزا به این دلیل انتخاب شد که یکی از سرپرست های پروژه به نام همیلتون اسمیت19 (برنده نوبل) یک دهه بر روی این میکروارگانیسم کار کرده بود و اطلاعات زیادی در مورد آن وجود داشت که برای موفقیت پروژه لازم بود.
ژنوم هموفیلوس آنفلونزا در یک کروموزوم حلقوی قرار گرفته که دارای 1830137 جفت باز است. این تعداد نوکلئوتید تشکیل 1740 ژن کد کننده پروتئین، 2 ژن کد کننده tRNA و 18 ژن کد کننده RNA را می دهد.
برای توالی یابی ژنوم از تکنیک shutgun sequencing استفاده شد. این پروژه یک سال طول کشید و در این مدت 24304 قطعه به صورت مجزا توالی یابی و سپس توسط نرم افزار کنار هم قرار داده شدند(72).
شکل 1-6: نقشه ژنتیکی حلقوی Haemophilus influenza Rd
1-9-1: ژنوم مولد کپسول پلی ساکاریدی
انواع هموفیلوس آنفلونزای کپسول دار دارای ژن های مشترک برای تولید کپسول پلی ساکارید20 مربوط به خود هستند که در جایگاه cap (cap locus) قرار گرفته اند(42).
جایگاه cap یک منطقه 18kb است که در همه سروتیپ ها دارای سه منطقه عملکردی جداگانه به نام های منطقه I,II.III می باشد (شکل 1-7).
شکل 1-7: ساختار ژنتیکی جایگاه cap در هموفیلوس آنفلونزا سروتایپ های a,b,c,d,e,f

منطقه I و III در همه سروتایپ های کپسول دار مشترک است و شامل ژن هایی است که برای تولید و ترشح کپسول پلی ساکاریدی ضروری هستند. مشابه این ژن ها در باکتری های گرم منفی دیگر از قبیل
Escherichia coli, Neisseria meningitides, Actinobacillus pleuropnumoniae, Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida دیده شده است. (63)
1-9-1-1: منطقه I
منطقه I دارای چهار ژن به نام های bexA,B,C,D می باشد که برای تولید سیستم ترشح کپسول وابسته به ATP کد می شوند و در انتقال پلی ساکارید به سطح سلول باکتری نقش دارد (41) (شکل1-8).
1-9-1-3: منطقه II
منطقه II دارای چهار ژن بوده و در هر سروتایپ منحصر به فرد است21 و آنزیم های کد شده توسط این منطقه باعث تولید دی ساکارید اختصاصی هر سروتایپ می شود(28،70).
این ژنها در Hib به نام های bcs1,2.3.4 شناخته میشوند. حرف اول (b) نشان دهنده نوع سروتایپ می باشد و سروتایپ های دیگر نیز به همین ترتیب نام گذاری می شود(شکل 1-8).
1-9-1-2: منطقه III
منطقه III شامل دو ژن به نام های hcsA و hcsB می باشد که به نظر می رسد در مراحل پلیمریزاسیون کپسول و حتی در اصلاحات و ترشح پلی ساکارید نقش داشته باشند (29)(شکل 1-8).
مطالعه سوکوپولوی22 و همکاران در سال 2006 نشان داد این دو ژن به صورت مکمل در تسهیل انتقال کپسول پلی ساکاریدی به سطح سلول و ویرولانس باکتری نقش دارند. غیر فعال کردن این ژن ها به صورت جدا از هم و همزمان در این مطالعه باعث تجمع پلی ساکارید در فضای پری پلاسمی سلول باکتری شد(67).
1-9-1-4: قطعه IS1016 23
همه سروتایپ ها حداقل یک کپی کامل از جایگاه cap دارند که به یک قطعه به نام IS1016 متصل است. در سوش های دارای بیش از یک کپی ، دو قسمت توسط یک قطعه IS1016 از هم جدا شده اند. یعنی به ابتدای هر جایگاه cap کامل یک قطعه IS1016 متصل است(57) (شکل 1-11).
قطعه IS1016 باعث سهولت در مضاعف شدن جایگاه cap در طول همانند سازی کروموزوم های خواهری، تحت تحت اثر نوترکیبی نامساوی می شود.
این قطعه در اغلب سویه ها به جایگاه cap متصل بوده و گفته می شود در یک سویه اجدادی از طریق جابه جایی24 به وجود آمده است.
این عناصر باعث جابه جایی جایگاه cap به عنوان یک ترانسپوزون در درون کروموزوم می شود و می تواند باعث تکثیر جایگاه cap در طول نوترکیبی همولوگ شده و منجر به افزایش تولید کپسول شود.
حذف شدگی در یکی از قطعات IS1016 به همراه بخشی از ژن bexA در Hib باعث ایجاد پایداری در ساختار دوتایی جایگاه cap می شود(34). این حذف شدگی باعث جلوگیری از حذف کپی دیگر bexA در طول نوترکیبی می شود. سویه های دارای حذف شدگی در تمام دنیا گسترش پیدا کرده و در حال حاضر عامل اغلب عفونت های ایجاد شده توسط Hib هستند. به همین دلیل به نظر می رسد حذف شدن این قطعه 1.2kb در سویه اجدادی یک نوع برتری زیستی به باکتری اعطا کرده است(40).
شکل 1-8: جایگاه cap و ژن های تشکیل دهنده
1-9-1-5: تعداد کپی جایگاه cap25
ساختارهای ژنتیکی تولید کننده کپسول Hib بارها مورد بررسی قرار گرفته است. این جایگاه به نام cap locus یا جایگاه cap شناخته می شود. در بیشتر موارد Hib دارای یک توالی دوتایی ناقص از جایگاه cap است اما در مواردی حتی تا 6 کپی از این جایگاه نیز گزارش شده است(19) . این دو جایگاه کاملا در مناطق II و III مشابه هم هستند، یکی از کپی ها دارای منطقه I کامل و دیگری معمولا دارای یک حذف شدگی به اندازه 1.2kb در منطقه I می باشد.، که این حذف شامل بخشی از ژن bexA و IS1016 می شود. به عبارتی یک کپی کامل به اندازه 18kb و یک کپی ناقص با حذف شدگی وجود خواهد داشت(63).
این آرایش دوتایی ناقص به باکتری اجازه تکثیر بیشتر ژن کپسول و در نتیجه افزایش تولید پلی ساکارید کپسولی را می دهد که باعث افزایش شدت بیماری زایی Hib می شود(57) .
تصور می شود وجود IS1016-bexA ناکامل در انتهای یکی از جایگاه ها به دلیل ایجاد ثبات در تولید کپسول با کاهش احتمال نوترکیبی می باشد.

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

با این حال منطقه ژنتیکی تولید کننده کپسول در این باکتری تا حدودی ناپایدار است و 5/0 – 1% از سوش های Hibبه صورت خود به خودی بیان کپسول خود را از دست می دهد. ولی در سروتایپ های غیر از b از دست دادن کپسول تا کنون گزارش نشده است (34،57).
اگر در طول نوترکیبی یک کپی کامل از جایگاه cap از بین برود کپی ناقص باقی خواهد ماند که شامل یک ژن bexA ناقص است (یک جزء متصل به ATP که برای انتقال اجزاء کپسول به سطح باکتری ضروری است). این نوع باکتری دارای یک کپی ناقص از جایگاه cap را Hib‾ با b‾ می نامند.(63) (شکل 1- 8-c)
1-9-1-6: تکامل ژنوم سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا
بر اساس آنالیزهای ژنتیکی، جمعیت کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا به دو گروه فیلوژنتیکی26 تقسیم می شود.

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید