2-1-3-4. اثر لیپو پلی ساکارید بر پرولیفراسیون فیبروبلاست‌ها22
2-1-3-5. اثر سینرژیسمی‌پروتئین نوترکیب CagA و لیپو پلی ساکارید در بروز پاسخ ایمنی مناسب علیه هلیکوباکتر پیلوری23
2-1-3-6. نقش حفاظتی لیپو پلی ساکارید در بقای پیوند سلول‌های بنیادی24
2-1-3-7. فعالیت ضد سرطانی لیپو پلی ساکارید25
2-2. سالمونلا28
2-2-1. پاسخ ایمنی میزبان به عفونت سالمونلایی29
2-2-1-1. پاسخ ایمنی ذاتی علیه سالمونلا29
2-2-1-2. پاسخ ایمنی اکتسابی علیه سالمونلا30
2-2-1-3. سایتوکاین‌ها و کموکاین‌های دخیل در عفونت سالمونلایی30
2-3. التهاب31
2-3-1. ویژگی‌های التهاب31
2-3-2. میانجی‌های التهاب32
2-4. لیپو پلی ساکارید و التهاب33
2-5. سیکلو اکسیژناز34
2-5-1. تاریخچه ی سیکلو اکسیژناز35
2-5-2. ساختار پروتئینی سیکلو اکسیژناز35
2-5-3. سیکلو اکسیژناز‌ها و سنتز پروستانوئید‌ها36
2-5-4. اعمال پروستاگلاندین‌ها37
2-5-5. بیولوژی سیکلو اکسیژناز37
2-5-6. فیبروبلاست و سیکلو اکسیژناز38
2-5-7. نقش سیکلو اکسیژناز-2 در آنژیوژنز39
2-5-8. سیکلو اکسیژناز و لیپو پلی ساکارید40
2-6. هیدروژن پر اکسید43
2-6-1. تاریخچه‌ی هیدروژن پر اکسید43
2-6-2. بیولوژی هیدروژن پر اکسید44
2-6-3. گونه‌های واکنشگر اکسیژن45
2-6-4. ROS و منابع تولید آن46
2-6-5. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی47
2-6-7. ردوکس و تمایز سلول‌های بنیادی49
2-6-8. ردوکس و تمایز سلول بنیادین جنینی به سلول‌های ماهیچه صاف (SMC)50
2-7. نیتریک اکسید51
2-7-1. سنتز نیتریک اکسید52
2-7-2. عملکرد NOS53
2-7-3. نقش‌های فیزیولوژیکی NO53
2-7-4. اثر NO بر رگ‌های خونی53
2-7-5. نقش NO در سیستم ایمنی54
2-7-6. نقش NO در التهاب54
2-7-7. نقش NO در سیستم عصبی55
2-7-8. NO و مرگ تدریجی سلول55
2-7-9. نقش iNOS در القای COX-255
2-7-10. نقش iNOS در تکثیر56
2-8. پوست57
2-8-1. فیبروبلاست58
2-9. زخم61
2-9-1. چگونگی ترمیم زخم طی روز‌های مختلف61
2-9-1-1. 24 ساعت اول61
2-9-1-2. روز سوم62
2-9-1-3. روز پنجم62
2-9-1-4. هفته‌ی دوم62
2-9-1-5. اواخر ماه اول62
2-9-2. مراحل ترمیم زخم63
2-9-2-1. مرحله‌ی التهابی63
2-9-2-1-1. میانجی‌های شیمیایی التهاب67
2-9-2-1-2. پروستاگلاندین‌ها و لوکوترین‌ها67
2-9-2-2. مرحله‌ی تکثیر67
2-9-2-2-1. ری اپیتلیالیزاسیون68

2-9-2-2-2. فیبروپلازیا68
2-9-2-2-3. آنژیوژنز69
2-9-2-3. مرحله‌ی بازسازی69
2-9-3. اهمیت ماکروفاژ‌ها در التیام زخم69
2-9-3-1. فنوتیپ ماکروفاژ‌های زخم70
2-9-3-2. اثر ماکروفاژ‌ها بر فیبروبلاست‌ها و میو فیبروبلاست‌ها71
2-9-3-3. ماکروفاژ‌ها در مرحله‌ی التهاب72
2-9-4. زخم و هیدروژن پراکسید73
2-9-4-1. اثرات مثبت استرس اکسیداتیو در التیام زخم77
2-9-4-1-1. انعقاد77
2-9-4-1-2. آغاز و دوام فاز التهابی78
2-9-4-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون78
2-9-4-1-4. آنژیوژنز و رسوب ماتریکس79
2-9-4-2. اثر منفی استرس اکسیداتیو و استرس نیترو اکسیداتیو در ترمیم زخم80
2-9-5. نیتریک اکسید و زخم82
2-9-5-1. اثر مثبت نیتریک اکسید در ترمیم زخم82
2-9-5-1-1. التهاب83
2-9-5-1-2. آنژیوژنز83
2-9-5-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون83
2-9-5-1-4. رسوب ماتریکس و بازسازی84
2-9-5-2. کاربرد نیتریک اکسید در درمان زخم85
فصل سوم: مواد و روش‌ها
3-1. مواد و وسایل و دستگاه‌های بکار رفته در آزمایش89
3-2. طرز تهیه‌ی محلول‌ها و معرف‌های بکار رفته91
3-2-1. محیط کشت DMEM91
3-2-2. FBS91
3-2-3. بافر PBS91
3-3. کشت سلول‌های فیبروبلاست91
3-4. آماده‌سازی غلظت‌های مختلف لیپو پلی ساکارید92
3-5. تیمار لیپو پلی ساکاریدی فیبروبلاست‌ها93
3-6. رنگ‌آمیزی XTT93
3-7. رنگ‌آمیزی تریپان بلو95
3-8. شمارش سلولی95
3-9. تعیین درصد زنده ماندن سلول‌ها95
3-10. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی96
3-10-1. آماده سازی نمونه‌ها96
3-10-2. روش کار96
3-11. تعیین میزان هیدروژن پر اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی97
3-11-1. آماده‌سازی نمونه‌ها97
3-11-2. منحنی استاندارد H2O298
3-11-3. مخلوط واکنش98
3-12. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 در نمونه لیز شده سلولی98
3-12-1. مواد99
3-12-2. آماده‌سازی محلول‌ها99
3-12-3. آماده‌سازی نمونه‌ها99
3-12-4. روش کار100
3-13. حیوانات آزمایشگاهی انتخاب شده برای تحقیق101
3-13-1. روش‌های نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی101
3-13-1-1. نیاز‌های محیطی موش کوچک آزمایشگاهی101
3-13-1-2. بستر مناسب103
3-13-1-3. رعایت اصول بهداشتی در نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی103
3-13-1-4. تغذیه104
3-14. اجرای الگوی زخم105
3-15. تیمار موضعی لیپو پلی ساکارید107
3-16. آماده‌سازی لیزات بافت109
3-17. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی بافت لیز شده110
3-17-1. آماده‌سازی نمونه‌ها110
3-17-2. روش کار110
3-18. تعیین میزان هیدروژن پراکسید برای نمونه‌های بافتی لیز شده111
3-18-1. آماده‌سازی نمونه‌ها111
3-18-2. منحنی استاندارد H2O2111
3-18-3. مخلوط واکنش112
3-19. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 برای نمونه‌های بافتی لیز شده112
3-20. بررسی هیستوپاتولوژیکی بافت‌های زخم شده113
3-21. آنالیز آماری113
فصل چهارم: نتایج
4-1. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 و 48 ساعت)116
4-2. بررسی اثر LPS بر میزان پرولیفراسیون سلول‌های فیبروبلاست با استفاده از روش XTT117
4-3. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)118
4-4. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز)119
4-5. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان NO در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله) 121
4-6. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان NO در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز)122
4-7. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان H2O2 در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)123
4-8. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان H2O2 در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز)124
4-9. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان COX-2 در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)125
4-10. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان COX-2 در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبرئبلاست با فاصله‌ی یک روز)126
4-11. اثر LPS بر میزان NO در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف127
4-12. اثر LPS بر میزان H2O2 در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف128
4-13. اثر LPS بر میزان COX-2 در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف129
4-15. نتایج نمونه‌های پاتولوژی132
فصل پنجم: بحث و پیشنهادات
5-1. اثر LPS سالمونلا انتریکا بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست138
5-2. بررسی اثر LPS بر زخم ایجاد شده در شرایط invivo142
5-3. اثر LPS بر میزان NO، H2O2 و COX-2 در شرایط invitro144
منابع149
خلاصه انگلیسی162
فهرست جداول
عنوانصفحه
جدول 4-1. نتایج حاصل از بررسی های پاتولوژیک لام های تهیه شده از بافت زخم135
فهرست نمودارها
عنوانصفحه
نمودار 4-1. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 ساعت)116
نمودار 4-2. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 48 ساعت)117
نمودار 4-3. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه اول که تیمار بلافاصله LPS داشتند (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)118
نمودار 4-4. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها با فاصله‌ی یک روز بعد از کشت سلولی بود (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)119
نمودار 4-5. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه اول که تیمار بلافاصله LPS داشتند (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)120
نمودار 4-6. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها با فاصله‌ی یک روز بعد از کشت سلولی بود (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)120
نمودار 4-7. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار) 121
نمودار 4-8. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) 122
نمودار 4-9. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار) 123
نمودار 4-10. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) 124
نمودار 4-11. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار) 125
نمودار 4-12. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) 126
نمودار 4-13. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم 127
نمودار 4-14. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم 128
نمودار 4-15. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم129
فهرست اشکال
عنوانصفحه
شکل 2-1. ترکیب غشای باکتری‌های گرم منفی غشای سیتوپلاسمی‌یا غشای داخلی، سلول باکتری را احاطه می‌کند.14
شکل 2-2. ساختار LPS از نوع صاف نشان دهنده‌ی انشعاب اختصاصی O، مرکز داخلی و خارجی، لیپید A می‌باشد15
شکل 2-3. ساختار LPS از نوع زبر.16
شکل 2-4. ساختار لیپید A در سالمونلا تیفی موریوم و اشریشیا کلی19
شکل 2-5. سالمونلا انتریتیدیس28
شکل 2-6. اجزای متقاطع التهاب31
شکل 2-7. متابولیسم اسید آراشیدونیک33
شکل 2-8. مسیر انتقال سیگنال توسط رسپتور‌های شبه تول34
شکل 2-9. مسیر بیوسنتز پروستانوئید‌ها36
شکل 2-10. تأثیر COX-2 بر آنژیوژنز40
شکل 2-11. اثر LPS بر تولید PGE241
شکل 2-12. نمایی از مکانیسم اثر LPS بر تحریک تولید COX-242
شکل 2-13. منابع تولید کننده ROS47
شکل 2-14. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی48
شکل 2-15. نقش ROS در چرخه‌ی سلولی50
شکل 2-16. مراحل سنتز نیتریک اکسید52
شکل 2-17. رابطه‌ی بین NO، COX-2 و ROS با LPS57
شکل 2-18. فیبروبلاست58
شکل 2-19. نمایی شماتیک از اندامک‌های داخلی فیبروبلاست60
شکل 2-20. مراحل ترمیم زخم پوستی63
شکل 2-21. نگاهی کلی به فاز التهابی ترمیم زخم65
شکل 2-22. روز سوم زخم (فاز التهابی)66
شکل 2-23. روز پنجم زخم (مرحله‌ی ری اپیتلیالیزاسیون و رگ‌سازی)66
شکل 2-24. کنترل مستقیم و غیر مستقیم ری اپیتلیزاسیون، آنژیوژنز و فعالیت فیبروبلاست‌ها توسط ماکروفاژها72
شکل 2-25. اثر سلول‌های مختلف در ترمیم زخم73
شکل 2-26. مدل فرضی از نقش گونه‌های واکنشگر اکسیژن در مکانیسم سیگنال‌دهی فاکتور رشد اپیدرمی در سلول‌های اپیتلیال80
شکل 2-27. مدلی فرضی برای تنظیم ساخت کلاژن84
شکل 3-1. احیای کلرومتریک XTT با آنزیم‌های سلولی94
شکل 3-2. نگهداری از حیوانات آزمایشگاهی101
شکل 3-3. نحوه قرارگیری موش‌های آزمایشگاهی در قفس‌های مخصوص105
شکل 3-4. روز صفر پس از اجرای الگوی زخم107
شکل 3-5. روزهای مختلف پس از اجرای الگوی زخم108
شکل 3-6. نحوه گرفتن بیوپسی از محل زخم و تقسیم‌بندی نمونه‌ها به منظور انتقال به آزمایشگاه‌های بیوشیمی و پاتولوژی109
شکل 4-1. عکس‌های حاصل از نمونه‌های پاتولوژیک134
خلاصه فارسی
اندوتوکسین‌ها از عمده‌ترین فاکتور‌های ویرولانس باکتری‌های گرم منفی هستند که به دلیل اثرات ایمونولوژیکی، پاتو فیزیولوژیکی و فارماکولوژیکی بر سلول‌های یوکاریوتی، مورد توجه قرار گرفته‌اند. ترمیم زخم ممکن است به دلیل نقص در مولکول‌های میانجی متوقف شود. لیپو پلی ساکارید (LPS) یکی از اصلی‌ترین محرک‌های تولید میانجی‌های التهابی به شمار می‌آید. هدف اصلی این تحقیق، بررسی اثر تجویز موضعی LPS سالمونلا انتریکا بر زخم تجربی ایجاد شده در پوست موش Balb/c و همچنین اثر آن بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست پوست می‌باشد. نمونه‌گیری از بافت‌های پوستی مربوط به گروه‌های شاهد و تیمار طی روز‌های 1، 2، 3 و 7 بعد از ایجاد زخم، به منظور بررسی‌های بیوشیمیایی و پاتولوژیکی انجام شد. میزان حیات سلولی با استفاده از روش XTT برای سلول‌های فیبروبلاست صورت گرفت. زخم‌های تیمار شده با LPS (100μg) نسبت به گروه شاهد، افزایش ارتشاح سلول‌های التهابی به محل زخم و افزایشی جزئی در میزان ضخامت لایه‌ی اپیتلیوم نشان دادند. سنجش سیکلو اکسیژناز-2 (COX-2)، هیدروژن پراکسید (H2O2) و نیتریک اکسید (NO) به منظور اثر احتمالی آنها در ترمیم زخم مورد ارزیابی قرار گرفت. در سنجش‌های بیوشیمیایی میزان NO، COX-2، H2O2 افزایش یافت (P˂0.001). بر اساس آزمون ANOVA، در بررسی میزان حیات سلول‌های فیبروبلاست تفاوت معنادار بین گروه‌های شاهد و تیمار مشاهده شد که البته این تفاوت وابسته به دوز مصرفی LPS و مدت زمان انکوباسیون بود. نتایج نشان می‌دهند که LPS با تحریک تولید میانجی‌های التهابی، توانایی افزایش مرحله‌ی التهابی ترمیم زخم را دارد. مطالعات گسترده‌تر با طراحی دوز‌های مختلف از LPS استرین‌های باکتریایی مختلف، فهم بهتری از مکانیسم اثر LPS در ترمیم زخم در مدل حیوانی نشان خواهد داد. به احتمال زیاد این یافته‌ها در توسعه‌ی روش‌های جدید برای درمان زخم‌ها ارزشمند خواهد بود.

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب(به صورت کاملا تصادفی و به صورت نمونه) با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود-این مطالب صرفا برای دمو می باشد

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

واژگان کلیدی: زخم، لیپو پلی ساکارید سالمونلا انتریکا، التهاب، نیتریک اکسید، سیکلو اکسیژناز-2، هیدروژن پر اکسید، فیبروبلاست
فصل اول
کلیات
1-1. بیان مسئله
سالمونلا انتریکا از دسته‌ی باکتری‌های گرم منفی بی‌هوازی اختیاری داخل سلولی است که سالانه باعث 1.3 میلیارد مورد بیماری در جهان می‌شود. از میان 6 زیر گونه‌ی سالمونلا که بر اساس تفاوت در فلاژل، کربوهیدرات و لیپوپلی ساکارید دسته‌بندی شده‌اند، بیش از 2500 سرووار مربوط به سالمونلا انتریکا شناخته شده است. سالمونلا می‌تواند طیف وسیعی از سلول‌ها مثل دندریتیک سل‌ها، ماکروفاژها، هپاتوسیت‌ها، نوتروفیل‌ها، کولونوسیت‌ها و سلول‌های اپی‌تلیال را مورد حمله قرار دهد. LPS سالمونلا از محرک‌های قوی پاسخ التهابی در ماکروفاژ‌ها محسوب می‌شود.
التهاب پوستی و نکروز هموراژیک که به توسط لیپوپلی ساکارید و لیپید A باکتری‌ها ایجاد می‌شوند، در موش مورد مطالعه قرار گرفته است. با تزریق داخل پوستی LPS S-form و لیپید A سالمونلا تیفی موریوم به موش ddy، بعد از 12 ساعت میزان نفوذپذیری رگها در آن منطقه تغییر می‌کند و باعث ادم می‌شود و به دنبال آن بعد از 24 تا 72 ساعت منجر به نکروز هموراژیک می‌شود. القای التهاب پوستی توسط LPS و لیپید A به ترتیب از بیشترین تاثیر تا کمترین تاثیر بدین صورت هستند:
Re-form LPS > Rc-form LPS > lipid A > Ra-form LPS > S-form LPS
ادم حاصل از تزریق LPS در پاسخ به فعالیت کمپلمان ایجاد می‌شود در حالیکه واکنش‌های هموراژیک به فعالیت سلول‌های هدف مثل ماکروفاژ‌ها و سلول‌های اندوتلیال درون رگی مربوط می‌شوند. جزیره‌ی بیماریزایی 2 سالمونلا (SPI2) برای فرار از ماکروفاژ‌ها و ایجاد عفونت سیستمیک در موش‌ها لازم می‌باشد. سالمونلا می‌تواند باعث فعال شدن ERK1/2 با واسطه‌ی SPI-2 شود و به دنبال القای تولید PGE2 و PGI2 در ماکروفاژ‌ها منجر به افزایش بیان COX-2 (سیکلواکسیژناز-2) شود. سایتوکاین‌ها و ایکوزانوئیدهایی چون پروستاگلاندین‌ها و لوکوترین‌ها در نحوه‌ی عملکرد ماکروفاژ‌ها تاثیر می‌گذارند. پروستاگلاندین‌ها (PGs) که در انواع مختلفی از سلول‌ها ساخته می‌شوند از جمله میانجی‌های مهم التهاب و پاسخ ایمنی محسوب می‌شوند. مرحله‌ی محدود کننده‌ی سرعت در سنتز PGs توسط COX کاتالیز می‌شود. COX-2 در انواع کمتری از سلول‌ها بیان می‌شود ولی به شدت با محرک‌های مختلفی مثل میتوژن‌ها، سایتوکاین‌ها، هورمون‌ها و انکوژن‌ها القا می‌شود، همچنین لیپو پلی ساکارید‌ها در القای بیان COX-2 در مونوسیت‌ها و ماکروفاژ‌ها سهیم هستند که این نوع از القا که با LPS ایجاد می‌شود، توسط مسیر سیگنال‌دهی انتقالی پروتئین کیناز تحریک شده با میتوژن (MAPK) تنظیم می‌شود. پروتئین SpiC کد شده توسط SPI-2 بوسیله‌ی سیستم ترشحی تیپ III به سیتوزول ماکروفاژ‌هایی که با سالمونلا آلوده شده‌اند منتقل می‌شود و با پروتئین‌های میزبان همچون TassC و Hook3 که در تردد سلولی نقش دارند وارد واکنش می‌شود. همچنین در مطالعاتی نقش SPI-2 در مهار فیوژن SCV (واکوئل‌های حاوی سالمونلا) با وزیکول‌های مسیر اندوسیتیک مثل وزیکول‌های حاوی نیتریک اکساید سنتتاز القایی (iNOS) و NADPH اکسیداز به اثبات رسیده است.
هنگامی‌که سالمونلا انتریکا سلول‌های پستانداران را مورد هجوم قرار می‌دهد سیگنال‌هایی را فعال می‌کند و منجر به افزایش بیان میانجی‌های التهابی می‌شوند. یکی از این میانجی‌ها، نیتریک اکسید (NO) است که تولید آن تحت کنترل آنزیم نیتریک اکسید سنتتاز القایی(iNOS) می‌باشد. این آنزیم در پوست در کراتینوسیت‌ها، فیبروبلاست‌ها، سلول‌های لانگرهانس و اندوتلیال‌ها القا می‌شود. تیپ وحشی سالمونلا می‌تواند هم میزان پروتئین iNOS و هم میزان mRNA مربوطه را در سلول‌های ماکروفاژ موش افزایش دهد. استرین‌های موتانت سالمونلا که فاقد SPI-1 هستند سیستم ترشحی تیپ III آنها کد نمی‌شود و همچنین استرین‌هایی که فاقد مولکول‌های تهاجمی ‌SipB, SipC, SipD هستند نمی‌توانند باعث القای iNOS شوند. نشت پلاسما در پوست موش به کمک جمع‌آوری موضعی pontamine sky blue در محل تزریق LPS اندازه‌گیری می‌شود. این مطالعات نشان می‌دهند که بالا رفتن میزان نفوذپذیری رگ‌ها بوسیله‌ی LPS، به میانجی‌گری NO حاصل از iNOS، ایکوزانوئید‌ها، هیستامین و TNF-α صورت می‌گیرد. تولرانس ایجاد شده بر علیه تغییرات نفوذپذیری که توسط LPS در رگ‌ها رخ می‌دهد با القای iNOS میانجی‌گری می‌شود نه با افزایش رهاسازی کورتیکواستروئید‌های اندوژنوز. نشت پلاسما در پوست بوسیله‌ی LPS حداکثر تا 2 ساعت رخ می‌دهد. تزریق زیر جلدی LPS هم در موش‌های تیپ وحشی و هم در موش‌های فاقد iNOS می‌تواند باعث افزایش نشت پلاسما شود به طوریکه اثر LPS در موش‌های فاقد iNOS نسبت به تیپ وحشی کمتر است. این نشان می‌دهد که LPS در افزایش میزان پروتئین iNOS در پوست رت نقش دارد. نتایج نشان می‌دهند که افزایش نفوذپذیری رگها توسط LPS در موش‌های وحشی بطور عمده وابسته به تولید NO به وسیله‌ی iNOS می‌باشد ولی در موش‌های فاقد iNOS،LPS با مکانیسمی‌مستقل از iNOS میزان نفوذپذیری رگها را تغییر می‌دهد که این کار را به واسطه‌ی میانجی‌هایی مثل ایکوزانوئید‌ها، هیستامین و TNF-α انجام می‌دهد. ایکوزانوئید‌ها که به طور عمده توسط COX-2 تولید می‌شوند، نقش خود را در نشت پلاسما در موش‌های فاقد iNOS و موش‌های وحشی ایفا می‌کنند. همچنین با مطالعاتی که روی دیفن هیدرامین، هیستامین و آنتی‌بادی ضد TNF-α انجام گرفته است، نقش آنها در افزایش نفوذپذیری رگها آشکار شده است. دلیل انتخاب COX-2 و iNOS در این تحقیق به دلیل القا پذیر بودن آنها می‌باشد، در ضمن این دو فاکتور القایی اثر سینرژیسمی‌بر روی یکدیگر دارند و افزایش یکی از آنها باعث افزایش دیگری و همینطور کاهش یکی از آنها باعث کاهش دیگری می‌شود.
فرآیند التیام زخم جلدی مستلزم واکنش بین سلول‌های موجود در درم و اپیدرم و رهاسازی میانجی‌های شیمیایی از سلول‌های التهاب‌آور، فیبروبلاست‌ها و کراتینوسیت‌ها می‌باشد. این فرآیند پیچیده شامل مهاجرت سلول‌ها، تکثیر سلول‌ها، حذف ماتریکس خارج سلولی، آنژیوژنز و ترمیم می‌باشد. امروزه زخم‌های مزمن یا زخم‌هایی که از توانایی ترمیم پائینی برخوردارند، از مشکلات مهم بالینی به شمار می‌روند و از آنجایی که در جوامع امروزی شیوع این نوع زخم‌ها با افزایش رخداد بیماری‌هایی مثل چاقی، دیابت ملیتوس و زخم بستر به طور پیشرونده‌ای بالا می‌رود، لذا تلاش‌های زیادی برای معرفی داروهای جدید با منشاء گیاهی یا شیمیائی که فرآیند ترمیم را تسریع می‌بخشند، صورت می‌گیرد. بهبود زخم در برخی از بیماری‌ها و اختلالات مزمن به یکی از چالش‌های علم پزشکی تبدیل شده است. به همین دلیل ترکیبات جدیدی که به منظور تسریع التیام زخم تهیه می‌گردند، مورد استقبال واقع می‌شوند.
اکسیدانت‌ها با سیگنال‌دهی و فراهم آوردن سیستم دفاعی بر علیه میکروارگانیسم‌ها نقش مهمی‌در التیام زخم دارند. همچنین با تکیه بر شواهدی که از مطالعات انسانی و حیوانی بدست آمده، می‌توان اثر سودمند NO در التیام زخم‌ها را بیان کرد که این موضوع به دلیل اثری است که NO در آنژیوژنز، التهاب، گشاد کردن رگ‌ها، تکثیر سلولی، تعمیر، ایمنی، تمایز سلولی و آپوپتوز می‌گذارد (8 و 12). تحقیقاتی که در این زمینه انجام گرفته‌اند نشان می‌دهند که ژن درمانی NOS و SODبه موجب افزایش NO و کاهش سوپراکسید، در تسریع التیام زخم‌های مقاوم به خصوص زخم دیابتی نوع 1 نقش دارند (7 و 13). همچنین نقش COX-2 در تکثیر و تمایز کراتینوسیت‌ها به دنبال خراشیدگی جزئی در پوست به اثبات رسیده است.
1-2. ضروریت انجام تحقیق
بر اساس بررسی‌های انجام شده در سطح کتابخانه‌ای و اینترنتی، این موضوع برای اولین بار در کشور مورد بررسی قرار می‌گیرد. از دلایل انتخاب این موضوع می‌توان به توجه کمی ‌که به پوست از لحاظ میکروبیولوژی شده است اشاره کرد و همانطور که می‌دانیم باکتری‌های گرم منفی همچون سالمونلا با سرووار‌های متعددی که دارند در محیط پیرامون ما به وفور حضور دارند و باعث بیماریزایی می‌شوند، پس احتمال اینکه از طریق زخم هم وارد پوست شوند وجود دارد، از سویی دیگر در ایران میزان استفاده از لوازم آرایشی نیز بسیار بالاست و امروزه زخم‌های مزمن یا زخم‌هایی که از توانایی ترمیم پائینی برخوردارند، از مشکلات مهم بالینی به شمار می‌روند. با توجه به این که آنزیم‌های iNOS و COX-2 القاپذیر هستند و از دسته عوامل مهم در التهاب، ایمنی‌زایی، تکثیر سلولی، تعمیر، آنژیوژنز، تمایز سلولی و آپوپتوز می‌باشند سنجش این آنزیم‌ها را انتخاب نموده‌ایم. در این تحقیق سعی می‌شود با تحریک این فاکتور‌ها توسط لیپو پلی ساکارید باکتری‌های گرم منفی در سلول‌های پوست، میزان تغییر فاکتور‌های التهابی و همچنین اثر احتمالی آنها در التیام زخم را مورد بررسی قرار دهیم.
1-3. اهداف پژوهش
1. تعیین میزان فعالیت COX-2 و NO و H2O2 در پوست سالم موش
2. تعیین میزان تغییر فعالیت آنزیم COX-2 پس از اثر دادن لیپوپلی ساکارید بر زخم پوست موش
3. تعیین میزان تغییر NO پس از اثر دادن لیپوپلی ساکارید بر زخم پوست موش
4. تعیین میزان تغییر H2O2 پس از اثر دادن لیپو پلی ساکارید بر زخم پوست موش
1-4. سئوالات و فرضیه‌ها:
1. با اثر دادن لیپوپلی ساکارید بر روی زخم پوست موش میزان فعالیت آنزیم COX-2 تغییر می‌کند.
2. با اثر دادن لیپوپلی ساکارید بر روی زخم پوست موش میزان فعالیت NO تغییر می‌کند.
3. با اثر دادن لیپوپلی ساکارید بر روی زخم پوست موش میزان فعالیت H2O2 تغییر می‌کند
4. تیمار لیپوپلی ساکارید بر روی زخم پوست بر تغییرات ترمیم و التیام زخم اثر دارد.

فصل دوم
مروری بر متون گذشته
2-1. لیپوپلی‌ساکارید
در سال 1991،Yoshihito Ishikawa و همکارانش التهاب پوستی و نکروز هموراژیک که به توسط لیپوپلی ساکارید و لیپید A باکتری‌ها ایجاد می‌شوند را در موش مورد مطالعه قرار دادند و به این نتیجه رسیدند که ادم حاصل از تزریق LPS در پاسخ به فعالیت کمپلمان ایجاد می‌شود در حالیکه واکنش‌های هموراژیک به فعالیت سلول‌های هدف مثل ماکروفاژ‌ها و سلول‌های اندوتلیال درون رگی مربوط می‌شوند.
در سال 1997، Umezava Kei و همکارانش با روش RT-PCR و روش ایمونوهیستوشیمی‌با آنتی‌بادی‌های اختصاصی iNOS افزایش میزان mRNA iNOS در بافت‌های آلوده شده با سالمونلا را گزارش کردند.
در سال 1997، Emiko Fujii و همکارانش نقش نیتریک اکساید، پروستاگلاندین و تیروزین کیناز را در فعالیت فاکتور رشد اندوتلیال رگ(VGEF) در پوست موش را مورد بررسی قرار دادند و به این نتیجه رسیدند که این عوامل در افزایش بیان VGEF و افزایش نفوذپذیری رگ‌ها و نشت پلاسما مؤثر هستند.
در سال 2000، Hiroysau Ishida و همکارانش طبق مطالعاتی که درباره‌ی تأثیر LPS و آنالوگ آن(OnO-4007) روی تغییر نفوذپذیری رگ‌ها در پوست موش انجام دادند به این نتیجه رسیدند که LPS می‌تواند 60 دقیقه بعد از تزریق، میزان نشت پلاسما را بالا ببرد ولی آنالوگ آن فقط در دوز‌های بالاتر می‌تواند اثر مشابه را بگذارد که این به دلیل تاثیر میانجی‌ها و رسپتور‌های متفاوت بر روی آنهاست.
در سال 2000، Andres Vazquez-Torres و همکارانش با بررسی رابطه‌ی بین ماکروفاژ‌ها و سالمونلا در کشت بافت به این نتیجه رسیدند که iNOS القا می‌شود.
در سال 2004،Kei-ichi Uchiya و Toshiaka Nikai با بررسی جزیره‌ی بیماریزایی 2 در سالمونلا به این نتیجه رسیدند که سالمونلا می‌تواند باعث فعال شدن ERK1/2 با واسطه‌ی SPI-2 شود و به دنبال القای تولید PGE2 و PGI2 در ماکروفاژ‌ها منجر به افزایش بیان COX-2 شود.

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

در سال 2000، Bobby J.Cherayil و همکارانش آنالیز القای بیان iNOS در ماکروفاژ‌ها توسط سالمونلا انجام دادند و به این نتیجه رسیدند که تیپ وحشی سالمونلا می‌تواند هم میزان پروتئین iNOS و هم میزان mRNA مربوطه را در سلول‌های ماکروفاژ موش افزایش دهد. میانجی نهایی القای iNOS، پروتئین افکتوری است که از طریق سیستم ترشحی تیپ III و در مسیری وابسته به SipB، SipC و SipD به داخل ماکروفاژ‌ها منتقل می‌شود.
در سال 2000، Emiko Fujii و همکارانش طی مطالعاتی که در مورد تزریق زیر جلدی و یا درون پوستی LPS در پوست موش و رت انجام دادند به این نتیجه رسیدند که افزایش نفوذپذیری رگها توسط LPS در موش‌های وحشی بطور عمده وابسته به تولید NO به وسیله‌ی iNOS می‌باشد ولی در موش‌های فاقد iNOS، LPS با مکانیسمی‌مستقل از iNOS میزان نفوذپذیری رگها را تغییر می‌دهد که این کار را به واسطه‌ی میانجی‌هایی مثل ایکوزانوئید‌ها، هیستامین و TNF-αانجام می‌دهد.
در سال 2001، Kaoru Irie و همکارانش طی مطالعه‌ای که روی اثر ضد التهابی عوامل افزایش دهنده‌ی CAMP در مدل موشی که نفوذپذیری درون رگی آن با لیپوپلی ساکارید تغییر یافته بود انجام دادند به این نتیجه رسیدند که عوامل افزایش دهنده‌ی CAMP با جلوگیری از بیان TNF-α به واسطه‌ی LPS، در کاهش میزان نفوذپذیری رگها اثر می‌گذارند. با تزریق زیر جلدی LPS به موش، پس از یک ساعت میزان TNF-α بالا می‌رود که در این زمان CAMP می‌تواند تولید آن را مهار کند و در کاهش نفوذپذیری رگ‌ها اثر بگذارد. ولی در مقابل، IL-1 که به واسطه‌ی LPS افزایش یافته است، تحت‌تاثیر هیچکدام از عوامل CAMP قرار نمی‌گیرد.
در سال 2011، حسین رستگار، حمیدرضا احمدی آشتیانی و همکاران با بررسی اثر LPS سالمونلا انتریتیدیس بر سلول‌های سرطانی کبدی، به این نتیجه رسیدند که افزودن LPS به محیطی که COX-2 دارد نه تنها LPS باعث بیان COX-2 نمی‌شود بلکه به مهارکننده‌ی COX-2 کمک می‌کند تا فعالیت COX-2 را کاهش دهد. از مهارکننده‌های COX-2 می‌توان در درمان سرطان استفاده کرد و با توجه به اینکه LPS در این مجموعه کمک‌رسانی می‌کند در آینده می‌توان در طراحی دارو‌های ضد سرطانی از آن استفاده کرد.
2-1-1. تاریخچه‌ لیپو پلی ساکارید
تب یکی از ابتدایی‌ترین یافته‌های علم پزشکی گزارش شده است. در سال‌های گذشته فرض محققین بر این بوده که تحریک کننده‌های تب وجود فیزیکی داشته و پیروژن نامیده می‌شدند که بر آمده از ریشه یونانی pyr به معنی آتش بود. با پیشرفت علوم گفته شد که تب تظاهری از بیماری یا دفاع میزبان علیه بیماری است. آلبرشت ون‌هالر1 پیشوایی در زمینه‌ی لیپو پلی ساکارید (اندوتوکسین) بود که نشان داد بعد از تزریق داخل وریدی اندوکسین، بافت تجزیه شده توانایی تحریک تب در حیوانات را دارد. در سال 1982 میلادی ریچارد فیفر2 گزارش کرد که ویبریو کلرا دارای توکسینی است که بخشی جدایی‌ناپذیر از بدنه‌ی باکتری است.
اندوتوکسین برای اولین بار در سال 1932 میلادی توسط آندره بوئیوین3 و لیدیا مسروبنو4 و بر اساس روش تری کلرو استیک اسید (TCA) خالص‌سازی شد. والتر مورگان5 و والتر گوبل6 با استفاده از حلال‌های ارگانیک و آب موفق به تخلیص اندوتوکسین شدند. یافته‌های هر دو گروه نشان می‌داد که اندوتوکسین ترکیبی از لیپید و پلی ساکارید و همچنین میزان کمی‌از پروتئین‌های مرتبط بود. با اینکه این ترکیب خام دستاوردی عظیم در درک ما از LPS بود، تصور روش‌های جایگزین دیگر برای تخلیص منجر به خالص‌سازی محصول با درجه‌ی بالا و درک بهتر مولکول می‌شد. اتو وستفال7 و اتو لودریتز8 دانشمندانی بودند که موفق به تخلیص با درجه‌ی بالاتر و اندوتوکسینی با فعالیت بیولوژیکی از باکتری‌های گرم منفی مختلف با روش استخراج آب- فنول داغ9 شدند. محصول آنها فاقد پروتئین و فقط حاوی کربوهیدرات، اسید‌های چرب و فسفر بود. آنها اولین کسانی بودند که کلمه‌ی لیپو پلی ساکارید را برای توضیح اندوتوکسین به کار بردند، اگرچه این کلمه در زمان جامعه‌ی دانشمندی آنها مورد قبول قرار نگرفته بود. همچنین مطالعات دیگری در رابطه با اثبات حضور LPS در باکتری‌های گرم منفی بیماریزا و غیر بیماریزا توسط وستفال و لودریتز صورت گرفت. در حال حاضر می‌دانیم که LPS در لایه‌ی بیرونی غشای خارجی باکتری‌های گرم منفی قرار گرفته است و موتانت‌هایی که دارای نقص در مراحل اولیه‌ی بیوسنتز LPS هستند زنده نمی‌مانند.
لیپو پلی ساکارید باکتریایی از اجزای اصلی لایه‌ی بیرونی غشای خارجی باکتری‌های گرم منفی است که در علم پزشکی اغلب به دلیل دارا بودن ویژگی‌های تنظیمی ‌ایمنی مورد استقبال قرار می‌گیرد. بطوریکه در مقادیر کم می‌توانند مفید واقع شوند ولی در مقادیر زیاد ممکن است باعث شوک اندوتوکسیک شوند. لیپو پلی ساکارید (LPS)10 از اجزای اصلی آمفی فیلیک در غشای بیرونی باکتری‌های گرم منفی است اما در طول تقسیم سلولی و انواع پروسه‌های بیوشیمیایی و همچنین با در دست گرفتن سیستم ایمنی میزبان می‌تواند در محیط رهاسازی شود. در واقع LPS به دلیل توانایی تحریک انواع اثرات بیولوژیکی در پستانداران و همچنین در تولید سایتوکاین‌های پیش التهابی همچون فاکتور نکروز دهنده تومور-α (TNF-α) و اینترلوکین‌ها، به نام اندوتوکسین خوانده می‌شود. تولید این میانجی‌ها در غلظت‌های پایین اندوتوکسین ممکن است منجر به اثرات بیولوژیکی مفید شوند ولی در غلظت‌های بالاتر، رهاسازی سایتوکاین‌ها می‌تواند منجر به سمیت خود بدن و در نتیجه ایجاد سندروم شوک شود. LPS شامل یک بخش قندی با شاخه‌هایی با اندازه‌های مختلف از پلی ساکارید (آنتی‌ژن O) تا الیگوساکارید که این وابسته به گونه‌های باکتریایی و یا موتانت‌های باکتریایی (فرم صاف LPS تا فرم زبر LPS) است و به صورت کوالان به قسمت هیدروفوبیک LPS یعنی لیپید A متصل می‌شود که آن هم در اتصال مولکول LPS به غشا نقش دارد (18).
شکل 2-1. ترکیب غشای باکتری‌های گرم منفی غشای سیتوپلاسمی‌یا غشای داخلی، سلول باکتری را احاطه می‌کند.
پری پلاسم که دارای پپتیدوگلیکان می‌باشد توسط غشای خارجی احاطه می‌شود. لیپو پلی ساکارید در لایه‌ی بیرونی غشای خارجی قرار دارد و حاوی 3 جزء متمایز لیپید A، مرکز الیگوساکاریدی و آنتی ژن O است. مرکز الیگوساکاریدی شامل یک تک قند به نام 2- کتو-2- دئوکسی اوکتونات (KDO) است (18).
2-1-2. ساختار لیپو پلی ساکارید
دسترسی به LPS خالص امکان مطالعه‌ی اجزای آن را به صورت جداگانه فراهم آورده است. خانواده‌ی انتروباکتریاسه (باکتری‌های بیماریزا و غیر بیماریزای گوارشی) از جمله سالمونلا و اشریشیا از نخستین باکتری‌هایی بودند که LPS آنها به صورت شیمیایی مورد بررسی قرار گرفت. مورفولوژی کلونی همه‌ی تیپ‌های وحشی استرین‌های این باکتری‌ها شبیه هم‌اند که کامل و صاف هستند (به جز برخی از موتانت‌ها که کلونی‌های زبر با لبه‌های نامنظم دارند). پیشنهاد لودریتز بعد از مطالعه‌ی صد‌ها LPS انتریک این بود که تمام اندوتوکسین‌ها ترکیبی از 3 اجزای عمومی‌هستند: انشعاب اختصاصی O، مرکز الیگوساکارید و لیپید A.
شکل 2-2. ساختار LPS از نوع صاف نشان دهنده‌ی انشعاب اختصاصی O، مرکز داخلی و خارجی، لیپید A می‌باشد (18).
(KDO 2- کتو-2- دئوکسی اوکتونات: ؛Hep:هپتوز ؛Hexهگزوز: )
همان طور که ذکر شد LPS از 3 ناحیه که به صورت کوالانت به هم متصلند تشکیل شده است. ناحیه لیپید A یا اندوتوکسین A در غشای خارجی مانند لنگری هیدروفوبیک عمل می‌کند و دارای فعالیت توکسینی است. ناحیه هسته، الیگوساکاریدی فسفریله شده است و در برابر آنتی‌بیوتیک‌ها در غشا خارجی به عنوان سد عمل می‌کند. ناحیه پلیمری آنتی‌ژن O الیگوساکاریدی ایمونوژنیک است که از واحد‌های قندی تکرار شونده تشکیل شده است. این واحد‌ها در گونه‌های مختلف و نیز از سویه‌ای به سویه‌ی دیگر متفاوتند. ناحیه‌ی لیپید A در تمام باکتری‌های گرم منفی یکسان است یا تفاوت اندکی دارد. ناحیه درونی هسته در محدوده وسیعی از گونه‌های باکتریایی یکسان است و در مواردی درجات محدودی از تمایز را نشان می‌دهد. اما ساختمان آنتی‌ژن O به طور قابل توجهی در باکتری‌های گرم منفی متفاوت است که پایه مهمی‌ برای تشخیص و تعیین گونه و سویه‌های باکتری‌های گرم منفی است. کلنی باکتری‌های گرم منفی بر حسب شکل ظاهری خود به دو فرم زبر (R)11 و نرم (S)12 تقسیم می‌شوند. در فرم S مولکول LPS به طور کامل بروز می‌کند در صورتی که در فرم R مولکول LPS فاقد آنتی‌ژن O به طور کامل است (6).
شکل 2-3. ساختار LPS از نوع زبر. پلی ساکارید اختصاصی O شامل تعداد مختلفی از واحد‌های تکراری پنتا ساکارید است. Hep: L- گلیسرو- D- مانو- هپتوز، Gal: گالاکتوز، Glc: گلوکز، GlcN: گلوکزآمین، GlcNAc: N- استیل گلوکزآمین، Kdo: 3- دئوکسی- D- مانو- اوکت-2- اولوسونیک اسید،L-Ara4N: 4- آمینو-4-دئوکسی-L – آرابینوز (6).
2-1-2-1. آنتی‌ژن O (شاخه‌ی اختصاصی O):
مطالعات نشان می‌دهند که آنتی‌ژن- O یک پلی ساکارید پیچیده است که حاوی واحد‌های تکراری 5 تا 8 مونوساکارید (گالاکتوز، رامنوز، مانوز و آبکوز در سالمونلا تیفی موریوم) می‌باشد. گونه‌های مختلف سالمونلا دارای انواع مختلفی از آنتی‌ژن‌های O هستند و آنتی سرمی ‌که ضد هر گونه از آن ایجاد می‌شود هیچ گونه واکنش متقاطعی با گونه‌ی دیگر ندارد. این یافته‌ها در طبقه‌بندی باکتری‌ها به سروتیپ‌ها که توسط کافمن، لودریتز و وستفال در سال 1960 میلادی پایه‌گذاری شد مؤثر بود. آنتی‌ژن O دارای فعالیت‌های بیولوژیکی متعددی همچون عرضه رسپتور برای باکتریوفاژ‌ها، تنظیم فعالیت مسیر آلترناتیو کمپلمان و مهار اتصال کمپلکس اتصال شونده به غشا به غشای خارجی باکتری است (77 و 64).
2-1-2-2. الیگوساکارید مرکزی
در سال‌های بعد مشخص شد که همه‌ی باکتری‌های گرم منفی دارای آنتی‌ژن O نیستند. این دسته از باکتری‌ها را با نام زبر (R) می‌خواندند چون کلونی‌هایی ناقص و ضخیم در روی آگار جامد تشکیل می‌دادند و در سالین اتوآگلوتیناسیون نشان می‌دادند. مطالعات در محور الیگوساکارید مرکزی با شناسایی موتانت‌های سالمونلا مینسوتا13 و سالمونلا تیفی موریوم14 فراهم شد. موتانت‌های زبری که تمام قسمت مرکزی را سنتز کنند ولی فاقد آنتی‌ژن O باشند را با نام Ra می‌شناسند و آنهایی که فاقد قند مرکزی باشند با نام Rb و موتانت‌هایی که دارای کوتاهترین قسمت مرکزی باشند را با نام Re می‌خوانند. اگر چه ناحیه‌ی مرکزی در میان گونه‌های باکتریایی فرق می‌کند ولی همه‌ی این نواحی‌ها دارای قند غیر معمول 2- کتو-3 – دئوکسی اوکتونات (KDO) هستند. از دیگر رزیدو‌های آن می‌توان به هپتوز، گلوکز، گالاکتوز و N- استیل گلوکز آمین اشاره کرد. حداقل میزان لازم برای بقای سلول، یک تک مولکول KDO می‌باشد که در LPS سالمونلا و اشریشیا کلی نوع Re حضور دارد. با توجه به شدیدترین موتانت یعنی Re می‌توان استنباط کرد که KDO باید مستقیماً به لیپید A متصل شده باشد. در مورد فعالیت بیولوژیکی ناحیه‌ی مرکزی بیرونی LPS یافته‌های زیادی وجود ندارد اما اعتقاد بر این است که هر دو مرکز بیرونی و درونی حامل اپی توپ‌هایی برای آنتی‌بادی هستند.
2-1-2-3. لیپید A
وستفال و لودریتز با کشف لیپید A اعتبار زیادی به دست آوردند. آنها در سال 1954 میلادی ساختار لیپیدی محلول در پیریدین و کلروفرم را از LPS و توسط تیمار آن با HCl به مدت 30 دقیقه و در دمای بالا خالص‌سازی کردند. تعیین ساختار لیپید استخراج شده نسبت به ناحیه‌ی مرکزی و آنتی‌ژن O مشکل بود، تا زمانی که تاکایاما ساختار کامل و صحیح لیپید A را در سال 1983 بیان کرد. در حال حاضر می‌دانیم که لیپید A دارای یک ستون دی گلوکز آمینی است که حاوی اتصالات β(1-6) می‌باشد. دو گروه فسفات در جایگاه 1 و 4 به این ستون وصل می‌شوند. این فسفات‌ها اغلب با گروه‌های قطبی مثل 4- آمیتو- 4- دئوکسی-L- آرابینوز و یا اتانول آمین تغییر می‌یابند که هر دو با تیمار اسید ملایم حذف می‌شوند تا تخلیص و مطالعه LPS صورت گیرد. برای اولین بار ترکیب اسید چرب لیپید A در اشریشیا کلی توضیح داده شد که 6 انشعاب اسید چرب به ستون لیپید A وصل می‌شوند، 2 تا از طریق اتصالات آمیدی و 4 تا از طریق اتصالات استری می‌باشد. اسید‌های چربی که اتصال آمیدی دارند منحصراً 3- هیدروکسی مریستات هستند اما اسید‌های چربی که اتصال استری دارند دارای امتداد‌های متنوعی مثل مریستات، لائورات و یا پالمیرات هستند. بعد‌ها کشف شد که 2 تا از 4 اسید چربی که اتصال استری دارند مستقیماً به ستون لیپید A وصل نمی‌شوند ولی در واقع به گروه‌های 3- هیدروکسیل در اسید‌های چرب با اتصالات تک استری و تک آمیدی اتصال می‌یابند (99و 101و 78 و 52).
شکل 2-4. ساختار لیپید A در سالمونلا تیفی موریوم و اشریشیا کلی. ستون لیپید A دارای یک بخش کربوهیدرات دی گلوکز آمین در پیوند بتا 1-6 است. انشعابات آسیل چرب اولیه با اتصالات آمیدی یا استری مستقیماً به ستون کربوهیدراتی وصل می‌شوند. انشعابات آسیل چرب ثانویه هم به گروه OH-3 برخی از انشعابات آسیل چرب اولیه وصل می‌شوند (64).
2-1-3. کاربرد لیپو پلی ساکارید در مطالعات ایمونولوژیکی
2-1-3-1. نقش لیپو پلی ساکارید باکتریایی در افزایش پاسخ ایمنی به کاندیدا آلبیکنز
مخمر‌هایی از جنس کاندیدا، پاتوژن‌های فرصت‌طلب انسانی در پوست، دستگاه گوارش و مجرای واژینال بوده که قادر به ایجاد عفونت‌های سیستمیک تهدید کننده حیات (در افرادی که دچار نقص سیستم ایمنی هستند) هستند. مکانیسم شناسایی ایمونولوژیکی کاندیدا توسط میزبان، مورد هدف بسیاری از مطالعات قرار گرفته است. سلول‌های سیستم ایمنی ذاتی، دسته‌ای از رسپتور‌های شناساگر الگو (PPRs)15 مثل رسپتور‌های شبه تول (TLRs)16 را بیان می‌کنند که در شناسایی میکروارگانیسم‌ها اهمیت دارند. این سلول‌ها همچنین باعث بیان رسپتور‌های لکتین تیپ-C (مثل دکتین-1 و دکتین-2) می‌شوند که نوعی PPR هستند و در شناسایی کاندیدا آلبیکنز17 نقش کلیدی دارند. دکتین-118، نوعی مولکول سطح سلولی است که الگوی بیان آن القایی بوده و قادر به اتصال به بتا- گلوکان می‌باشد که بتا- گلوکان از اجزای کربوهیدراتی اصلی دیواره سلولی کاندیدا آلبیکنز است. شناسایی کاندیدا آلبیکنز توسط دکتین-1 نه تنها به تشکیل سیناپس‌های رسپتوری برای فاگوسیتوز کاندیدا منتهی می‌شود بلکه باعث آغاز سیگنال‌دهی سلولی برای تولید سایتوکاین‌ها می‌شود. نقص در دکتین-1 انسانی با پیشرفت عفونت مزمن کاندیدایی مرتبط است (93 و 29).
عملکرد LPS تا حدودی تعجب‌آور بود چون در ماکروفاژ‌ها و دندریتیک سل‌های بالغ، میزان بیان دکتین-1 را کاهش می‌داد ولی در مونوسیت‌ها باعث افزایش بیان دکتین-1 می‌شد. کاهش بیان با افزایش تولید سایتوکاین‌های التهابی مرتبط بود. LPS در مراحل اولیه‌ی عفونت با تحریک بیان دکتین-1 باعث تحریک سلول‌های ایمنی ذاتی میزبان (مونوسیت) می‌شود که این امر منجر به شناسایی کاندیدا آلبیکنز خواهد شد. در مراحل آخر عفونت و پس از بلوغ مونوسیت‌ها به ماکروفاژ‌ها و دندریتیک سل‌ها، ممکن است LPS باعث آغاز سیگنال‌دهی سلولی به سمت مهار دکتین-1 و تحریک سایتوکاین‌های التهابی برای راه‌اندازی پاسخ التهابی شود.
استنباطی دقیق از نحوه‌ی تغییر فنوتیپیکی ماکروفاژ‌ها در حضور LPS، نقش کلیدی در توضیح مکانیسم التیام زخم و رفع عفونت دارد. LPS با تحریک بیان دکتین-1 در مونوسیت‌های انسانی باعث افزایش تولید IL-23 و IL-17 می‌شود که در افزایش فاگوسیتوز کاندیدا موثرند. بنابراین LPS ممکن است با تحریک عملکرد سیستم ایمنی ذاتی به منظور شناسایی کاندیدا، در مراحل اولیه‌ی عفونت کاندیدایی مؤثر باشد. بکار گیری این نتایج برای درمان و کنترل بیماران مبتلا به عفونت‌های کاندیدایی که تحت درمان آنتی‌بیوتیکی هستند بسیار مورد توجه قرار گرفته است (79).
2-1-3-2. نقش لیپو پلی ساکارید در تسریع ترمیم زخم اپیتلیوم مجاری تنفسی
LPS به عنوان یک محصول باکتریایی می‌تواند باعث تسریع ترمیم زخم در سلول‌های اپیتلیال مجاری هوایی از طریق مسیر زیر شود:

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید